Environmental Science & Technology丨Single-Cell Analysis of Microbial Degradation Mechanisms and Remediation Potential for Emerging Pollutants: A Case Study on Methylnaphthalene

2025年2月14日，中国科学院广州地球化学研究所李继兵、罗春玲老师团队在《Environmental Science & Technology》期刊发表了题为“Single-Cell Analysis of Microbial Degradation Mechanisms and Remediation Potential for Emerging Pollutants: A Case Study on Methylnaphthalene”的论文。文章通过稳定同位素-拉曼活细胞分选（RACSSIP）技术和基因测序技术，首次在石油污染废水中原位鉴定了两株2-甲基萘（MP）高效降解功能微生物——鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）和假单胞菌（Pseudomonas sp.），并揭示了其差异化的代谢途径，为环境中新污染物的生物修复提供了重要的理论依据和技术支撑。长光辰英核心产品——PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪为MP降解菌的筛选与分离提供了关键技术支撑。

一、研究背景

烷基多环芳烃（PAH衍生物）是一类新兴环境污染物，其烷基取代结构降低了水溶性，导致生物累积性和毒性增强，对生态系统和人类健康构成严重威胁。微生物降解是消除这类污染物的核心途径，但传统培养技术难以原位分离功能微生物，且环境微生物存在分离和培养困难，无法深入探究其代谢机制和群落互作机制。

稳定同位素探针（SIP）技术作为一种无需分离培养的功能微生物群落筛选技术，配合PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪能够原位识别和分离环境功能微生物，结合单细胞基因检测技术，能够深入探究功能微生物的代谢机制，实现原位探查环境多环芳烃衍生物降解菌并对污染物的降解途径进行深入了解。

二、研究方法

本研究采用2-甲基萘（MP）为模型PAH，分别采用¹²C和¹³C标记的MP作为底物添加到石油污染废水中，经PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪对环境微生物进行拉曼光谱采集后，通过特征峰的位移识别¹³C标记的MP活性降解微生物。同时，对两种MP孵育的废水微生物群落进行16s扩增子测序判断群落结构差异。接着，对两组微生物群落的总DNA进行提取，进行DNA-SIP实验，计算对应基因的相对富集因子（Relative Enrichment Factor，REF）以判断特定基因对MP降解的参与程度。对分选到的MP活性降解菌进行全基因组扩增后测序，探究MP代谢通路与功能基因。最后，将分离培养的原位降解菌与已有的高效MP降解菌进行降解效率评估，强调真实环境中原位污染物降解微生物的重要性。

图1 SIP-RACS实验流程与分选培养菌降解效率评估示意图

三、结果

1. 拉曼光谱揭示13C标记MP活性降解菌

¹³C标记的MP与废水共孵育4天后，¹³C-MP处理组中功能微生物细胞在968 cm^-1和768 cm^-1处出现显著拉曼光谱峰位移，而¹²C-MP组无此现象（图2 a）。其中，¹³C-MP标记的细胞中968 cm^-1峰位由¹²C-MP中1001 cm^-1位置红移得到，而768 cm^-1峰位由782/784 cm^-1位置红移得到。对各峰位的拉曼光谱峰强进行统计，¹³C标记细胞的968 cm^-1和768 cm^-1峰强度显著高于¹²C-MP组（p < 0.001），验证了同位素标记的有效性（图2 b）。  

图2 活性MP降解菌SIP标记后在污染废水中的拉曼光谱检测

图a为¹²C-MP和¹³C-MP原位孵育后的细胞单细胞拉曼光谱，分别标记为¹²C-cell和¹³C-cell。t = 0天的光谱表示¹³C-MP在时间0天时处理的细胞。每个光谱是来自40个细胞的SCRS的平均值。图b为¹³C-MP活性细胞、¹³C-MP未标记细胞和¹²C-MP细胞分别在768、781、967和1001 cm⁻¹处的拉曼光谱峰强统计

2. MP活性降解微生物鉴定

将上述RACS-SIP分析得到的¹³C-MP标记活性微生物单细胞进行分离和单细胞基因组扩增（图3 a），对分离的40个单细胞基因组进行16S rRNA扩增子测序分析，确定了两种对MP降解至关重要的微生物：鞘氨单胞菌（Sphingomonas sp.）和假单胞菌（Pseudomonas sp.），这两株菌的16s rRNA基因与Sphingomonas echinoides strain 14与Pseudomonas simiae PICF7的相似度分别达到99.9%和98.5%（图3 b）。  

图3 MP活性降解菌的单细胞分离与鉴定

图a为分选芯片上MP降解活性微生物细胞的鉴定（左）与分离（右）；图b为基于16S rRNA基因序列鉴定¹³C标记的活性MP降解菌的微生物系统发育树

通过DNA-SIP验证上述鉴定的两株MP活性代谢菌在降解¹³C-MP中的作用，结果发现Sphingomonas sp.（ASV_27）与Pseudomonas sp.（ASV_97）在¹³C标记的重DNA中的REF值分别为12.0和60.1，相对丰度分别为0.91%和7.89%，显著富集，因此，将Sphingomonas sp.与Pseudomonas sp.确认为原位MP降解功能菌（图4 ab）。  

图4 DNA-SIP实验中两种MP活性降解菌的REF比较与功能基因丰度差异

图a为SIP识别活性降解菌在DNA-SIP实验中的相对富集因子(REF)；图b为培养4天后¹³C-MP环境中鞘氨单胞菌和假单胞菌的相对丰度变化，T0为未孵育的原废水样品；图c和图d为¹²C-MP和¹³C-MP微环境中提取的DNA中nfd (c)和nah (d)基因丰度与浮力密度（BD, g/mL）的相关性，其中“轻”和“重”的DNA片段被高亮显示

3. MP降解菌代谢途径解析与分离培养

对RACS-SIP分离的降解菌进行基因测序与分析，在Sphingomonas sp.中注释到了萘双加氧酶基因nah1和nah2，在Pseudomonas sp.中注释到了nah3和3 -萘甲醛脱氢酶nfd。这表明Sphingomonas sp.菌株具有将芳香环羟基化的MP降解能力，而Pseudomonas sp.则可通过芳环羟基化和甲基末端氧化双通路来降解MP（图5 a）。

从RACS-SIP分选的细胞中成功培养了一株命名为Sphingomonas sp. LJ（下称LJ）的目标菌株，通过16S rRNA基因测序证实其与RACS分选的Sphingomonas sp.具有100%的相似性。

 图5 2株MP活性代谢菌的代谢通路示意图与分离培养菌代谢效率评估

图a为¹³C-MP标记分选细胞的MP代谢途径重建示意图；图b为分选培养菌株LJ与传统MP降解菌GIG1、GIG2分别在MM培养基和废水中MP的生物降解效率评估

为了评估原位功能微生物的污染物降解效果，采用传统方法分离出高效MP降解菌GIG1和GIG2。将这两株菌和和RACS-SIP分选出的菌株LJ分别在MM培养基与原始废水中进行降解效果评估。结果显示，传统菌株GIG1和GIG2的降解率（88.1%和80.2%）在MM培养基中显著高于原位菌株LJ（63.4%），但在实际废水环境中LJ的降解率显著提升（87.1%），而GIG1/GIG2无显著差异（65.5–66.3%）。该结果表明，通过稳定同位素探针标记技术（RACS-SIP）筛选获得的环境原位功能微生物，在实际环境条件下展现出显著的多环芳烃（MP）降解优势。这一发现不仅证实了原位功能微生物在复杂环境体系中的高效降解能力，更凸显了特定环境条件下本土微生物群落对污染物生物修复的关键作用。该研究成果为开发基于原位微生物强化的环境修复技术提供了重要的科学依据和实践指导。

四、结论

本研究创新性地采用单细胞拉曼分选-稳定同位素标记联用技术，首次在单细胞分辨率水平上揭示了石油污染废水中多环芳烃衍生物的微生物降解网络。Sphingomonas sp.和Pseudomonas sp.通过互补的差异化代谢途径形成协同降解体系，显著提升了废水中甲基化多环芳烃的降解效率。特别值得注意的是，经RACS技术分选培养的Sphingomonas sp. LJ功能菌株在实际环境条件下展现出卓越的降解性能，这一发现不仅验证了原位功能微生物在环境修复中的独特优势，更为多环芳烃衍生物等新兴污染物的生物修复策略制定和原位监测技术开发提供了重要的理论依据和技术支撑。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.est.4c14757

五、辰英价值

本研究借助长光辰英自主研发的PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪，运用RACS-SIP技术，成功实现了对石油污染废水中¹³C标记的活性MP污染物降解菌的精准识别与无损分离。该仪器集成了拉曼光谱检测与基于激光诱导向前转移（LIFT）原理的单细胞分选系统，为探究MP降解菌的功能基因与代谢通路开辟了新途径。其搭载的HOOKE IntP软件，具备批量处理及同位素偏移峰分析功能，为¹³C引发的拉曼光谱峰位移分析提供了有力支持。综上所述，PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪为复杂环境中功能微生物的精准鉴定提供了新策略，为环境新兴污染物的生物修复策略奠定了坚实技术基础。

六、团队介绍

李继兵

中国科学院广州地球化学研究所副研究员，硕士生导师。2018年于中国科学院大学获博士学位。曾获广东省杰出青年基金、广州市科技菁英“领航”计划。入选中国科学院广州分院年度优秀青年科技工作者、“中国科学院青年创新促进会”会员、“广东省100位博士博士后创新人物”和“国家博士后创新人才支持计划”，获得中国科学院优秀博士学位论文和中国科学院院长优秀奖等。主要从事环境微生物技术和土壤有机污染，尤其是发展和利用稳定同位素示踪（SIP）-单细胞拉曼分选和分子生物学联用技术，开展多环芳烃/石油烃及其衍生物等有机污染物的生物降解研究。相关成果发表SCI论文50余篇，第一/通讯作者SCI论文31篇，包括ISME J、Environmental Science & Technology、Water Research、Soil Biology and Biochemistry、Environmental Microbiology、Applied and Environmental Microbiology等国际权威期刊论文，授权国内国际发明专利15件。现任国际期刊《Resources, Environment and Sustainability》及《地球化学》青年编委。

罗春玲

博士，研究员。2006年，于香港理工大学获博士学位。学科方向为环境有机地球化学。近期研究主要集中在有机污染物在土壤-植物系统的迁移转化、土壤生物修复、污泥资源化利用。研究成果发表SCI刊物论文150余篇，论文被SCI引用5000余次，参与编写论著3部，授权发明专利10余项。现任中国土壤学会土壤环境专业委员会委员、中国土壤学会国际合作专业委员会委员、中国环境科学学会新污染物治理专业委员会委员、广东省可持续发展协会理事。曾入选中国科学院国外杰出人才引进计划“百人计划”（2010）、中组部“万人计划”青年拔尖人才（2017）、获国家优秀青年基金（2014）资助。